HPLC法中，等度与梯度洗脱有什么区别？两者分别适合怎样组分的分离

梯度洗脱：在同一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比

hplc梯度洗脱设计原则_液相色谱中梯度洗脱适用于

hplc梯度洗脱设计原则_液相色谱中梯度洗脱适用于

hplc梯度洗脱设计原则_液相色谱中梯度洗脱适用于

等度洗脱则是指从头到尾只是用同一个流动相。

用不用梯度洗脱，主要看杂质的情况。同一物质有梯度和等度两种条件时，梯度的认可度较高。杂质与杂质、主峰、溶剂峰的分离度一定要好（不好的话就要用梯度）。

（1）杂质和主成分极性相很大，杂质一定要全部都能洗脱出来（有时等度情况下从两三个小时杂质也冲出不来，就必须考虑等度）。

（2）杂质和主成分极性相较大，杂质出峰太晚（等度冲两个小时出来个杂质，就可以通过梯度缩短检样时间）

（3）还有就是杂质极性比主峰的大，等度时要想主峰时间合适杂质全堆在前边，杂质分开主峰又出峰太晚，这种情况也得考虑梯度洗脱。

在能达到较好的分离度的情况下能用等度就用等度，毕竟用梯度要麻烦一些。

希望对你有帮助。

请问做液相色谱时在什么样的情况下必须进行梯度洗脱?这跟流动相的种类有无关系?

讨论这个问题，必须要先讨论等度洗脱和梯度洗脱相比：

等度洗脱优点是流动相比例不随时间进行变化，这样，能限度保证压力稳定，基线平直，在连续进样时，可随时停止，如果上一针有没有跑出来的峰，下一针也能直接看到，不会漏检峰，还有就是在一般性外标或内标时，当样品出峰较晚时，可采用简单方法极快检测。举例：假如主峰在10分钟出峰（无其它干扰峰），你正常进一针，然后等两三分钟再进一针，再等两三分钟进一针，这样一共运行20分钟就出了三个峰，这样的方法对标准样和样品的检测时，能极大缩短时间。而此方法用梯度是不可行的。所以等度洗脱在内外标时作用。

梯度洗脱是等度的辅助，但这些年一般的归一化检测已经取代了等度。主要是因为，等度洗脱如果出峰较多时，就会使各峰峰宽出现前窄后宽，积分上也有现象，还有就是等度洗脱有的出峰过早有的过晚，还有的两峰相隔过宽或过窄，这时，梯度的作用就非常明显了。它可以把出峰过早的峰用低有机相-高水相向后拖动，便于分离，还能把后面出峰较晚的峰用高有机相-低水相提前跑出来。这样的好处不仅能节约时间，还能使各峰峰型都比较窄，积分更准了。

用梯度和等度与流动相也有一定关系。比如正相色谱时是不能用梯度的，在反相色谱时，等度，梯度都可以使用。

HPLC原理及基本作是什么？

原理

高效液相色谱法仪根据各种各样的相互作用力来分离混合物。这种相互作用力通常是分析物及分析管柱之间的一种非共价性质。

使用高效液相色谱时，液体待检测物在不同的时间被注入色谱柱，通过压力在固定相中移动，由于被测物中不同物质与固定相的相互作用不同，不同的物质顺序离开色谱柱，通过检测器得到不同的峰信号，每个峰顶都代表一个另外化合物的种类，后通过分析比对这些信号来判断待测物所含有的物质。

以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪。采用高压输液泵，高效固定相和高压灵敏检测器等装置的液相色谱仪成为高效液相色谱仪。高效液相色谱仪种类繁多，但不论何种类型的高效液相色谱仪，基本上都分为4个部分：高压输液装置，进样系统，分离系统和检测系统。

作

将要分离和分析的样品混合物以不连续的小体积（通常为微升）引入渗透通过色谱柱的流动相流中。样品的组分以不同的速度通过色谱柱，这是与吸附剂（也称为固定相）的特定物理相互作用的函数。每个组分的速度取决于其化学性质，固定相（柱）的性质以及流动相的组成。

特定分析物洗脱（从色谱柱中出现）的时间称为其保留时间。在特定条件下测得的保留时间是给定分析物的识别特征。

可以使用许多不同类型的色谱柱，其中填充了粒径，孔隙率和表面化学性质各异的吸附剂。使用较小的颗粒尺寸的包装材料需要使用较高的作压力（“背压”）的和通常改善的色谱分辨率（连续的分析物从柱中出现的峰之间的分离度）。吸收剂颗粒本质上可以是疏水的或极性的。

常用的流动相包括水与各种的任何混溶性组合（常见的是乙腈和甲醇）。一些HPLC技术使用无水流动相（请参见下面的正相色谱法）。

流动相的水性成分可能包含酸（例如甲酸，磷酸或）或盐以帮助分离样品成分。在色谱分析过程中，流动相的组成可以保持恒定（“等度洗脱模式”）或变化（“梯度洗脱模式”）。等度洗脱通常在分离与固定相亲和力非常不同的样品成分时非常有效。

在梯度洗脱中，流动相的组成通常从低到高洗脱强度变化。流动相的洗脱强度由分析物的保留时间反映，高洗脱强度可产生快速洗脱（=较短的保留时间）。

反相色谱中的典型梯度曲线可能始于5％的乙腈（在水或水性缓冲液中），然后在5–25分钟内线性增长至95％的乙腈。恒定流动相组成的周期可以是任何梯度曲线的一部分。例如，流动相的组成可以在5％的乙腈中保持1-3分钟，然后线性变化直至95％的乙腈。

流动相的选定组成取决于各种样品组分（“分析物”）和固定相之间的相互作用强度（例如，反相HPLC中的疏水相互作用）。根据它们对固定相和流动相的亲和力，在色谱柱中进行分离过程中，分析物会在两者之间分配。

此分配过程类似于液-液萃取过程中发生的分配过程，但该过程是连续的，而不是逐步进行的。在此示例中，使用水/乙腈梯度洗脱，一旦流动相在乙腈中的浓度更高（即，在洗脱强度更高的流动相中），则更多的疏水性组分将较晚洗脱（从色谱柱中洗脱）。

流动相组分，添加剂（例如盐或酸）和梯度条件的选择取决于色谱柱和样品组分的性质。通常对样品进行一系列的试验，以便找到可以充分分离的HPLC方法。

用途

高效液相色谱作为一种重要的分析方法，广泛的应用于化学和生化分析中，常用于医品、化学、环保、生命科学、与食品工业的研究上。

高效液相色谱从原理上与经典的液相色谱没有本质的别，它的特点是采用了高压输液泵、高灵敏度检测器和高效微粒固定相，可将液体混合物中的成分分离、成分定性及定量分析。适于分析高沸点不易挥发、分子量大、不同极性的有机化合物。例如：可检测分析食品中的的含量。

HPLC法中，等度与梯度洗脱有什么区别？两者分别适合怎样组分的分离？

梯度洗脱：

同析周期

按定程序

断改变流

相浓度配比

等度洗脱则

指尾

用同

流相

用用梯度洗脱

主要看杂质

情况

同物质

梯度

等度两种条件

梯度

认度较高

杂质与杂质、主峰、溶剂峰

离度

定要

（要用梯度）

（1）杂质

主极性相

杂质

定要全部都能洗脱

（等度情况

两三

杂质

冲必须考虑等度）

（2）杂质

主极性相较

杂质

峰太晚（等度冲两

杂质

通梯度缩短检

间）

（3）

杂质极性比主峰

等度

要想主峰

间合适杂质全堆

前边

杂质

主峰

峰太晚

种情况

考虑梯度洗脱

能达

较离度

情况

能用等度

用等度

毕竟用梯度要麻烦

些希望

帮助

HPLC分类及其原理

HPLC分类有很多种，可以根据不同的依据进行分类。

1. 根据流动相和固定相的极性不同，HPLC可以分为正相色谱和反相色谱。

正相高效液相色谱： 色谱柱中的固定相是由硅胶、氧化铝等极性化合物组成。当色谱运行时，由于样品中的极性化合物对固定相有较强的亲和力，使它们在色谱柱中的保留时间比非极性化合物长，因此非极性化合物被洗脱出来。许多物质都可以用正相色谱法分析，但由于物、食物和其他生物制品大都是非极性的，所以在日常生活中应用不如反向色谱法广泛。

反相高效液相色谱 ：固定相由非极性化合物组成，如硅烷、C18、C8等有机化合物。流动相是极性的。因此，极性高的化合物被洗脱，低极性或无极性的化合物后洗脱。

HPLC大都是对物、食品、生化分子等物质进行分析，而它们在自然界中都是极性物质（水溶性）。因此，反相高效液相色谱应用更为广泛。

2. 根据分离原理的不同，HPLC可分为以下六种。

亲和色谱： 主要利用样品与固定性之间的亲和性，实现分离。

离子交换色谱： 基于固定相与流动相的带电基团发生可逆交换，达到分离目的。离子交换树脂用于分离含有带电离子的样品。对于阴离子，使用阴离子交换树脂；对于阳离子，使用阳离子交换树脂。主要用于分离酸性和碱性化合物。

离子对色谱： 在反相色谱的流动相或固定相中加入离子配对剂，与样品中可电离的成分形成“对离子”。常用的离子配对剂有戊烷、己烷、庚烷或盐等。

吸附色谱： 是利用吸附性不同的原理，根据样品中的组分对固定相的亲和力不同而发生分离。

空间排阻色谱： 按样品中的组分的分子大小顺序进行分离。色谱柱是由琼脂糖、葡聚糖、聚等软凝胶制成，也可用烷基葡聚糖、聚等半刚性凝胶。

手谱： 用于分离样品中的光学活性异构体。固定相采用化学键合硅胶。常应用于医、生物等领域。

3. 根据分析目的不同，HPLC可以分为分析型液相色谱和制备型液相色谱。

分析型液相色谱： 主要利用检测器对混合物中各组分进行定性和定量分析。

制备型液相色谱： 主要是对混合物中各组分进行分离纯化。制备型的色谱柱和进样量都比分析型大。

4. 正如大家所知道的，混合物的分离是由于流动相流过HPLC色谱柱完成的，其中流动相可以是单一的溶剂，也可以是混合溶剂，因此HPLC可以分为等度洗脱和梯度洗脱两种类型。

等度洗脱： 只有一种溶剂，所有的作都是在一种溶剂下进行的。

梯度洗脱： 流动相由两种或两种以上的溶剂组成，并不断改变其浓度配比。

迪信泰检测平台以液相/气相为依托，组建领先的HPLC、LC-MS、GC-MS等检测平台，为广大科研工作者提供高质量、快速、精准的一站式检测服务，涉及生物、食品、物、化妆品、环境等多领域。

参考资料：Types Of HPLC | Their Principle And Application

液相色谱仪的梯度洗脱有哪些优点？该如何选择

梯度洗脱装置分两种：高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。梯度洗脱可提高分离度、缩短分离时间、降低小检测量和提高分离精度。但在使用中，梯度洗脱也有许多与等度洗脱不同的地方需要注意。梯度洗脱时应注意:1、注意各溶剂间的互溶性。2、对溶剂的纯度要求更高（影响重现性）。3、注意梯度变化时系统压力的变化，防止超出限度。4、梯度结束后，用初始流动相冲洗，使柱子平衡一段时间（再生），使系统回复到初始状态。（梯度周期）5、低压梯度要注意脱气，混合后容易产生气泡。6、容易出现峰，应作空白试验。7、梯度选择时尽量几相之间相变化要小,否则不易平衡。8、梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示折光检测器）。9、要注意水相中盐的浓度，防止在有机相提升过程中盐的析出。